DNA-Färbung von Hefen
DNA Färbung von S. cerevisiae mit Propidiumjodid oder Sytox Green
Propidiumjodid (PI, MW = 668.4, mutagen) ist Membran impermeabel und interkaliert zwischen die Basen von DNA und RNA. Daher wird PI auch zur lebend/tot Unterscheidung eingesetzt (tote Zellen sind PI positiv, lebende nicht). Die Fluoreszenzintensität der PI-Färbung ist ungefähr proportional zur Anzahl der Basenpaare und sie ist konzentrationsabhängig (siehe Abb. 1). Die PI-Fluoreszenzintensität ist nicht exakt stöchiometrisch weil, durch die Einlagerung von PI in die Basenzwischenräume der DNA, die DNA gespannt wird und somit der 100%igen PI-Einlagerung entgegensteht. Dies hat jedoch keinen Einfluss auf das Verhältnis von G1- zu G2-Peak innerhalb einer Probe. Da PI auch in doppelstränige RNA interkaliert muss bei der DNA Analyse von Zellen mit PI die RNA verdaut werden um ein optimales DNA-Profil zu erhalten.
Abb. 1: Stationäre Hefen, Saccharomyces cerevisiae, wurden mit unterschiedlichen PI-Konzentrationen (PI-Zugabe unmittelbar vor der Messung) an einem FACSAria gemessen. Die Abbildung zeigt die Zunahme der PI-Fluoreszenz in Abhängigkeit von der PI-Konzentration. Die einzelnen Messpunkte der Kurve "C1 Mean" zeigen den jeweiligen Mittelwert (Mean) der G1 Population und die Messpunkte der "Difference" Kurve geben die Differenz zwischen der G1 und der G2 Population an. Die Intensität der PI-DNA-Färbung ist stark abhängig von der PI-Konzentration.
Bei der DNA Analyse von Hefen mit PI an einem FACS macht sich die mitochondriale DNA (mtDNA) aufgrund ihres hohen Anteils deutlich bemerkbar als Verbreiterung und wandern der Populationen in den positiven Bereich. Die Angaben über Anzahl der Mitochondrien in Hefen schwanken von 1 bis 50, je nach Stamm, Züchtungsbedingungen und Alter der Zelle. Somit kann der Anteil der mitochondrialen DNA zwischen 0,4% (1 Mitochondrium) und 20% (50 Mitochondrien) schwanken. Beim Menschen macht sich die mtDNA praktisch nicht bemerkbar weil sie nur ca. zu einem 1/100000stel vorhanden ist.
| DNA-Gehalt | Basenpaare |
|---|---|
| Mensch (Homo sapiens) | 3,1*109 bp |
| Mitochondrien (Mensch) | 1,7*104 bp |
| Hefe (Saccharomyces cerevisiae) | 2,0*107 bp |
| Mitochondrien (Hefe) | 0,8*105 bp |
Bei einer DNA-Messung von Hefen kann die Analyse verbessert werden indem nicht nur ein einfaches DNA-PI-Profil dargestellt wird, sondern indem man PI-Area versus PI-Width darstellt (Area = Integral des Messimpulses, Width = Breite des Messimpulses) (siehe Abb. 2).
Abb. 2: FACS-Daten und lichtmikroskopisches Erscheinungsbild. Das einfache DNA-Profil (oben links, graue Fläche) von Saccharomyces cerevisiae birgt noch weitere Informationen, die in der Dot Plot-Darstellung (Area versus Width, oben rechts) sichtbar werden. Durch diese zweidimensionale Darstellung der PI-Signale können nicht nur Zellen mit einfachem (1C, Population P1) und doppeltem Chromosomensatz (2C, Populationen P2+P3) unterschieden werden sondern auch Zellen mit doppeltem Chromosomensatz in der Mutterzelle (Population P2) und Zellen mit doppeltem Chromosomensatz verteilt auf die noch zusammenhängenden Mutter- und Tochterzellen (Population P3). Um diese FACS-Daten dem äußeren Erscheinungsbild zuordnen zu können wurden die Populationen P1, P2 und P3 auf Objektträger sortiert und lichtmikroskopische Fotos einzelner Hefezellen aufgenommen (unterer Bildzeile). Als typische Bilder zeigten sich: Eine Hefezelle mit einfachem Chromosomensatz (1C, unten links), eine Hefezelle mit doppeltem Chromosomensatz (2C) in der Mutterzelle und einer Knospe in der sich aber noch keine Chromosomen befinden (unten Mitte) und ein typisches Bild von einem zusammenhängenden Partikel in dem bereits der doppelte Chromosomensatz (2C bzw. 1C+1C) auf die Mutter- und auf die Tochterzelle verteilt ist (unten rechts).
Methode
Material
• Hefen: Saccharomyces cerevisiae
• 70% EthOH (eiskalt)
• RNAse: 2 mg/ml RNAse A
• Citrate Puffer: 50mM Na citrate
• Citrate-RNase Puffer: 50mM Na citrate mit 0.1 mg/ml RNase A
• Citrate-PI Puffer: 50mM Na citrate mit Propidiumjodid (PI) 8µg/ml
• Citrate-Sytox Green Puffer: 50mM Na citrate mit Sytox Green 2µM
Zellpräparation
• Hefen wachsen lassen bis zu einer Konzentration von OD600=0,6 (2 x 107 cells/ml: OD=1)
• 1ml in ein Eppendorfgefäß überführen, abzentrifugieren (5 min 6000xg
• Pellet in 1ml 0,2 M Tris (pH 7,5) waschen (5 min 6000xg)
Fixierung
• Pellet vortexen und gleichzeitig in 1 ml 70% EthOH resuspendieren, bei 4ºC lagern
• Zellen 2x waschen (5 min 6000xg) in Citrate Puffer, Überstand abnehmen
• Zellen resuspendieren in 0,5ml Citrate-RNase Puffer, 37ºC für 2h
DNA Färbung
Propidium Iodide Färbung
• 0,5ml Citrate-PI Puffer zugeben (= 4µg/ml PI), bei 4ºC lagern
Alternativ Sytox Green Färbung
• 0,5ml Citrate-Sytox Green Puffer zugeben (= 1µM Sytox Green), bei 4ºC lagern
• sonifizieren
• messen
Referenzen
H.A. Crissman and J.A. Steinkamp J. Cell. Biol. 59, 766, `73
J. Fried et al. J. Cell. Biol. 71, 172, `76
A. Krishan J. Cell. Biol. 66, 188, `75
Haase SB, Reed SI. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 2002 Mar-Apr;1(2):132-6.