Oberflächenfärbung

Die wichtigste Anwendung des FACS ist die Mehrfarbenfluoreszenzanalyse mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Diese Mehrfarbenfluoreszenzanalyse ermöglicht die Korrelation mehrerer Zellparameter und ist somit unerlässlich bei der Darstellung von Subpopulationen, bei der Zelldifferenzierung und der Antigenexpression.

Da FACS Analysen auf eine gute Trennung von positiven und negativen Populationen angewiesen sind, ist eine optimierte Färbemethode notwendig. Dazu gehören, neben einwandfreien Färbereagenzien, eine austitrierte Färbekonzentration (siehe Abb. 1) und eine optimale Färbezeit (siehe Abb. 2 und 3).

Abb. 1: Gezeigt ist die Titration des Antikörpers 1.108 auf der positiven T-Zelllinie EL4. Die Kontrollzelllinie 18.81 zeigt keine signifikante Zunahme der Fluoreszenz. Die optimale Färbekonzentration ist bei 30 µg/ml erreicht, deutlich zu sehen an der "difference"-Kurve (EL4-Kurve - 18.81-Kurve).

EL4 T-Zelllinie (EL4-F15-16-Tk25) (L. Old et al. 1965);18.81.1 preB-Zelllinie (P.D. Burrows et al. (1981); Referenzen siehe auch Diplomarbeit, Köln, 1987

Abb. 2: Die Abbildung zeigt einen austitrierten Antikörper (CD20FITC) auf Lymphozyten nach einer Minute Färbezeit. Die Lymphozyten wurden FSC versus SSC gegatet. Die positive Population ist bereits deutlich von der negativen Population getrennt.

Abb. 3: Die gesamten Messdaten des Versuchs aus Abb. 2 zeigen, dass bereits nach fünf Minuten das Färbeplateau erreicht ist. Als Sicherheitsfaktor sollte die gleiche Zeit noch einmal dazugegeben werden. Somit ergibt sich für eine optimale Oberflächenfärbung mit einem austritierten Antikörper eine Färbezeit von zehn Minuten. Eine längere Färbezeit bringt keine Verbesserung der Färbung sondern ein wandern der negativen Population in den positiven Bereich und somit eine Verschlechterung der Trennung von positiver und negativer Population. Der Anstieg der negativen Population über die Zeit ist bei der CD20-negativen-Population (grüne Linie) und vor allem bei der Monozytenpopulation (blaue Linie) deutlich zu sehen.

Methode

Färbelösungen

• möglichst direkt gekoppelter Antikörper --> z.B. mit FITC (Fluoreszein-isothiocyanat) oder PE (R-Phycoerytrin)
• 1-100µg/ml (testen siehe Abb. 1.1) in PBS / 1% Serum Albumin / 0.03% Na-Azid (PBS/BSA/N₃)

Oberflächenfärbung

• Zellen waschen (350xg/10min)
• Zellen aufteilen zu 0.5-1*10⁶/ml
• Pellet + 10-20µl austitrierter Färbelsg. (z.B. anti-CD4 FITC), 10min RT
• waschen 350xg, 10min
• resuspendieren in ca. 500µl (5*10⁵ bis 1*10⁶)
• analysieren