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FACS Facility Labor - Information und Wissenswertes

Die folgenden Seiten sind eine kleine Einführung in Theorie und Praxis der Durchflusszytometrie. von Klaus L. Meyer

Was ist ein FACS?
FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) wird meist im Sinne von Durchflusszytometrie benutzt und ist mit diesem austauschbar. FACS ist eine Methode zur Analyse und Aufbereitung (trennen, aufreinigen) von Einzelzellen in Suspension auf der Grundlage von Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften.
Das Prinzip des FACS ist von L.A. Herzenberg et al. (Sci. Am. 234, 108, 1976) ausführlich beschrieben worden (siehe auch Abb. 1). Die hohe Analysegeschwindigkeit und Empfindlichkeit ebenso wie die objektive Quantifizierung und die multiparametrische Korrelationen eröffnen der Durchflußzytometrie ein nahezu unbegrenztes Anwendungsfeld in der Forschung und Diagnostik.

Grundvoraussetzung zur Messung mit einem Durchflusszytometer ist das Vorliegen der Probe als Einzelzellsuspension. Es sind Partikel mit einem Durchmesser von 1 µm unterscheidbar. Tabelle 1 gibt eine Übersicht über Anwendungen der Durchflusszytometrie.

Tabelle 1: Partikel die im FACS gemessen werden können  
Blutzellen  
Knochenmark  
Tumorzellen  
Pflanzenzellen  
Protoplasten  
Hefen  
Bakterien  
Viren  
Bedingung: monodisperse Partikelsuspension  

Abb. 1: Sortieren von grün und rot markierten Zellen.

Fluoreszenzmarkierte Einzelzellen in einem dünnen Flüssigkeitsstrahl werden durch einen oder verschiedene Laserstrahlen (kohärentes Licht) geführt (Analysepunkt) und die dabei emittierten unterschiedlichen Lichtsignale mit Hilfe mehrerer Photovervielfältigerröhren (PMT, Photomultiplier tubes) in elektronische Signale verwandelt und als Messdaten gespeichert. Dazu werden jeweils die Impulshöhen der einzelnen Parameter bestimmt, digitalisiert und die Werte einem Computer zur Korrelation und quantitativen Auswertung übertragen. Selbst kleine Subpopulationen von seltenen Zellen können so identifiziert und in ein separates Röhrchen sortiert werden mit einer erreichbaren Reinheit von etwa 100%. Gemessen werden zwei Datenarten: Streulichtparameter und Fluoreszenzparameter.

Die Lichtstreuung ist ein physikalischer Prozess, bei dem ein Partikel (Zelle) mit Licht interagiert. Dabei wird nur die Richtung, nicht die Wellenlänge (Farbe) des anregenden Lichtes verändert.

Zelleigenschaften welche die Lichtstreuung beeinflussen:
- Zellgröße
- Struktur der Zellmembran
- intrazelluläre Bestandteile


Fluoreszenz ist das durch Strahlung angeregte Leuchten eines Stoffes.

Fluoreszierende Verbindungen absorbieren Lichtenergie in einen für sie charakteristischen Wellenlängenbereich, heben dabei Elektronen in ein höheres Energienieveau und mit dem Zurückfallen zum Grundniveau emittiert das Elektron ein Photon. Diese Lichtemission wird als Fluoreszenz bezeichnet. Das Lichtspektrum, über den eine fluororeszierende Verbindung angeregt werden kann, bezeichnet man als Absorptionsspektrum. Da beim Absorptionsübergang immer mehr Energie aufgenommen wird, als beim Fluoreszenzübergang emittiert wird, ist das abgestrahlte Licht langwelliger als das Anregungslicht und bildet das Emissionsspektrum.

Parameter Funktion
Streulichtparameter  
Vorwärtsstreulicht (FSC, Forward Scatter ungefähre Zellgrösse
Seitenstreulicht (SSC, Side (90°) Scatter ) Zellgranulrität und Zellkomplexität

Fluoreszenzparameter

Darstellung von Subpopulationen, zelluläre Strukturen und Funktionen

Die Anwendungen in der Durchflusszytometrie sind sehr vielfältig weil mehrere spezifische Fluoreszenzparameter kombiniert werden können, jede Zelle individuell analysiert wird und separiert werden kann. Über Durchflusszytometrie gibt es viele gute Bücher.

Hier einige Beispiele:

• Flow Cytometry and Cell Sorting, Second Edition, Editor Andreas Radbruch (Springer Verlag 2000, ISBN 3-5406-5630-8)

• Flow Cytometry: A Practical Approach. Edited by MG Ormerod. (IRL Press, Oxford. 1994. ISBN 0-19 963461-0)

• Practical Flow Cytometry. 3rd Edition. Howard M Shapiro. (Alan R Liss, Inc. ISBN 0-471-30376-3)

• Flow Cytometry. First Principles. Alice Longobardi Givan.(Wiley-Liss, New York, 1992. ISBN 0-471-56095-2)

 

Laser und Fluorochrome

Im FACS werden verschiedene Laser eingesetzt.

 

Wellenlänge Laserart Anwendung
488 nm Halbleiter- oder Argonlaser Streulicht und grüne gelbe u. rote Fluorochrome
633 nm Helium-Neon-Laser vornehmlich rote Fluorochrome
407 nm Halbleiterlaser blaue Fluorochrome
Multiline-UV-Laser Argonlaser DNA-Farbstoffe u. vornehmlich blaue Fluorochro

Die Auswahl der Fluorochrome ist abhängig von der Anregungsmöglichkeit und der jeweiligen Anwendung. Die folgende Liste zeigt eine kleine Auswahl der (Haupt-) Fluoreszenzfarbstoffe mit deren Anwendung die hier in dieser FACS facility genutzt werden können.

Fluoreszenzfarbstoff Laser [nm] Ex max. [nm] Em max. [nm] Anwendungen
R-Phycoerythrin (PE) 488 565 578 Phänotypisierung
Green Fluorescent Protein (GFP) 488 495 510 Reportermolekül
Fluorescein diacetate (FDA) 488 495 519 Lebendfarbstoff
Alexa 488 488 499 519 Phänotypisierung
Sytox Green 488 504 523 DNA Analyse
PE-Cy5 (TriColor, Cychrome) 488 565 666 Phänotypisierung
PE-Cy7 (PC7) 488 565 778 Phänotypisierung
Propidium Iodide (PI) 488 530 625 DNA Analyse
Rhodamine 123 (R123) 488 507 525 Mitochondriales Membranpotential
Yellow Fluorescent Protein (YFP) 488 519 534 Reportermolekül
7-Aminoactinomycin D (7AAD) 488 546 655 DNA Analyse
TO-PRO-3 (TP3) 633 643 661 DNA Analyse
APC-Cy7 633 650 778 Phänotypisierung
Allophycocyanin (APC) 633 650 660 Phänotypisierung
         


Die Mehrfarbenfluoreszenzanalyse ermöglicht die Korrelation mehrerer Zelleigenschaften und ist somit unerlässlich bei der Darstellung kleiner Subpopulationen, bei der Untersuchung der Zelldifferenzierung, der Zellproliferation und der Protein (Antigen) -expression. Neben der gemeinsamen Anregbarkeit der Farbstoffe müssen die einzelnen Emissionsmaxima deutlich voneinander getrennt sein zur Messung mit den verschiedenen Detektoren (PMTs).

Signalverarbeitung

Beim Passieren des Analysepunktes senden die Zellen Signale aus, die von den PMTs empfangen und die Werte mittels einem Computer verarbeitet und gespeichert werden. Die gemessenen Signale können linear oder logarithmisch dargestellt werden. Je nach seiner Konzeption kann ein Durchflußzytometer bis zu 15 Parameter (2 Lichtstreuungen und 13 Fluoreszenzen) an einzelnen Zellen simultan messen.

Datenauswertung

Einparameterdarstellung
Ein Histogramm ist eine die Häufigkeitsverteilung der Messsignale eines gemessenen Parameters. Die horizontale Achse gibt dabei die Intensität der Einzelmessungen wider, die vertikale Achse die Anzahl der Zellen. Auf diese Weise entsteht die Gaußverteilung eines Parameters die als Population bezeichnet wird. Bei einer Zellfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern ist die Fluoreszenzintensität direkt proportional zur Anzahl der vorhandenen Bindungsstellen (Antigene), d.h. je mehr Bindungsstellen vorhanden sind desto heller leuchtet die Zelle. Außerdem hängt die Position einer Population (Mean) von der eingestellten Verstärkung der PMTs und den verwendeten Filtern ab.

Die Durchflusszytometrie zeigt also die Verteilung der verschiedenen Fluoreszenzintensitäten anhand einer relativen Skala. Der Benutzer muss angeben welche Bereiche für "positiv" oder "negativ" gelten sollen, damit eine gegebene Population richtig bewertet wird, diese Bereiche werden mit Kontrollen definiert.

Zweiparameterdarstellung

Werden zwei verschiedenen Parametern während einer Messung erfasst reicht eine Histogrammdarstellung nicht aus und man bedient sich einer zweidimensionalen Darstellung, um so die Korrelationsverteilung der Parameter zu zeigen. Diese korrelierten Zweiparameterdarstellungen werden in der Regel als "Punktdarstellungen" ("Dotplot") dargestellt. Auf diese Weise lassen sich Subpopulationen charakterisieren und identifizieren. Zur quantitativen Auswertung werden Grenzen anhand der Kontrollmessungen gesetzt.

Die Durchflusszytometrie und Zellsortierung hat heute ihnen festen Platz in der Forschung dank eines nahezu unbegrenzten Anwendungsbereiches. Dabei steht im Zentrum des Interesse immer die einzelne Zelle. Im Gegensatz zu den traditionellen biochemischen und zytochemischen Verfahren werden keine Durchschnittswerte einer Zellaufbereitung erhalten, sondern die Korrelation des Ergebnisses mit der einzelnen Zelle bleibt erhalten.