Datenauswertung
Datenauswertung
In der Durchflusszytometrie sind Populationen (Häufigkeitsverteilungen) von Zellen definiert durch ihre Streulichtparameter - Vorwärtsstreulicht (FSC) und Seitenstreulicht (SSC) - sowie durch ihre Fluoreszenz, welche beschrieben wird durch den relativen Mean (Mittelwert) und den CV (coefficient of variation, Variationskoeffizient), und durch den prozentualen Anteil der Population. Dabei werden Signale von z.B. 10000 spezifisch immunfluoreszenz-markierten Zellen mit 3 - 15 korrelierten Parametern aufgenommen. Da es sich um eine Relativmessung handelt muss mit Hilfe von Kontrollen definieren werden was als "positiv" oder "negativ" gelten soll. Bei der anschließenden Auswertung wird zunächst eine Vorauswahl der Rohdaten vorgenommen (FSC versus SSC Gate siehe Abb. 1) und anschließend wird die Grenze zwischen einer negativen und einer positiven Population festgelegt, wobei man sich häufig an einer Negativkontrolle orientiert ("Schwellenmethode"). Ein Gate (eine definierte Region) kann natürlich auch auf die Fluoreszenzparameter gesetzt werden, um z.B. eine bestimmte Lymphozytenpopulation auszuwählen. Alle Gates können miteinander verknüpft werden - in der Regel mit einem logischen UND. Die Gates wirken also wie hintereinander geschaltete Filter. Ein anschauliches Beispiel über die Wirkungsweise hintereinander geschalteter Gates zeigt die Abb. 3 im Menüpunkt Multiparameteranalyse.
Abb. 1: Das Beispiel zeigt einen Dot Plot mit Maus-Milzzellen und einem Scatter-Gate (P1) auf Lymphozyten inklusive der größeren aktivierten Lymphozyten. Zelltrümmer ebenso wie Zellaggregate werden von der weiteren Analyse ausgeschlossen indem nur die Zellen weiter verwendet werden die in die Region P1 fallen.
Der große Vorteil der Durchflusszytometrie liegt in den korrelierten Fluoreszenzparametern bei einer Mehrfarbenfluoreszenzanalyse (Multi-Color Analyse) (siehe auch: Multiparameteranalyse und Sortierung). Dabei können aber Fluoreszenzspektren überlappen, welche dann zu falschen doppelt positiven Ergebnissen führen können. Daher muss mit Hilfe von Kontrollen oder Einstellpartikel, wie z.B. die CaliBRITE Beads von BD, kompensiert werden.
Kompensation
Als Kompensation bezeichnet man das anteilige Abziehen einer sich bemerkbar machenden benachbarten Fluoreszenz bei überlappenden Fluoreszenzspektren. Eine Kompensation ist z.B. bei einer Analyse mit nur einem Laser (488nm, Einpunktanregung) und den beiden Fluoreszenzfarbstoffen PE und FITC notwendig (siehe Abb. 2 und Abb. 3). Bei der Kompensation wird auf rechnerischem Wege von einem Fluoreszenzsignal eine relative Menge abgezogen und die Differenzlichtmenge als kompensiertes Signal bezeichnet. Ein Nachteil der Kompensation ist, dass die positive Population, aufgrund der logarithmischen Verstärkung, in Kompensationsrichtung auseinander gezogen, also breiter gestreut wird (siehe Abb. 3 und Klaus L. Meyer, 1987).
Abb. 2: Die Abbildung zeigt die überlappenden Fluoreszenzspektren von FITC und PE mit den jeweils zu kompensierenden Anteilen der übersprechenden Fluoreszenzen bei Verwendung der Bandpassfilter BP530/30 für FITC und BP576/26 für PE. Es ist deutlich zu erkennen, dass eine FITC-gefärbte Zelle bzw. Partikel auch im PE-Kanal positive ist (grüne Fläche). Dieses überlappen von FITC in den PE Messbereich würde unkompensiert eine falsch doppelt positive Population ergeben. Daher muss bei überlappenden Fluoreszenzspektren anhand von Kontrollen sehr sorgfältig kompensiert werden.
Abb.3: Gezeigt werden hier die CaliBRITETM Beads von BD in einer FITC versus PE Dot Plot Darstellung. Links sind die Partikel unkompensiert und recht kompensiert dargestellt. Es ist deutlich zu erkennen, dass die kleine nur FITC positive Population (links im Quadranten Q2) auch einen erheblichen PE positiven Anteil hat der sich wie eine doppelt positive Population darstellt und daher kompensiert werden muss. Rechts ist diese nur FITC positive Population kompensiert worden, so dass sie in den Quadranten Q4 zu liegen kommt wobei sie deutlich in Kompensationsrichtung breiter geworden ist. Richtig kompensiert ist, wenn der Mittelwert (Mean) der Population (Q4) mit dem Mittelwert der negativen Population (Q3), jeweils in PE-Richtung, übereinstimmt. Es ist daher falsch sich beim setzen der Quadranten an der negativen Population zu orientieren ohne das Kompensationsverhalten der positiven Populationen zu berücksichtigen.
Im Gegensatz zu einer Einpunktanregung mit nur einem Laser muss bei einer Anregung mit zwei oder drei Lasern nicht unbedingt kompensiert werden, da man die Fluoreszenzfarbstoffe so wählen kann, dass die Fluoreszenzspektren nicht oder nur wenig überlappen. Außerdem sind die Messpunkte bei einer Mehrpunktanregung räumlich und damit zeitlich voneinander getrennt. Jeder Messpunkt bekommt dabei sein eigenes zeitlich begrenztes Messfenster, in dem nur das Fluoreszenzlicht von einem Anregungspunkt gemessen wird. Somit ist z.B. bei einer Zweipunktanregung mit einem 488nm Laser und einem 633nm Laser und den Fluoreszenzfarbstoffen FITC und APC eine Kompensation nicht notwendig (siehe auch: Multiparameteranalyse und Sortierung Abb. 2).
Datenauswertung bei überlappenden Populationen
Wenn sich z.B. bei immunfluoreszenzgefärbten Zellen klar getrennte Populationen durch die Fluoreszenzintensität ergeben ist die Analyse einfach. Die Grenze zwischen positiver und negativer Population kann in der Mitte zwischen den Populationen gesetzt werden ("Talmethode": Abb. 5 und Abb. 6) oder sich an der Negativkontrolle orientieren ("Schwellenmethode": Abb. 4 und Abb. 6). Das Ergebnis ist in beiden Fällen annähernd gleich. Bei klar getrennten Populationen spielt also die Wahl zwischen Talmarker und Schwellenmarker keine Rolle (Abb. 5), da durch die Aufbereitung und Fluoreszenzmarkierung von Zellen leicht gröbere Fehler auftreten können.
Problematisch wird es bei überlappenden Populationen, da sich weder bei einem Dot Plot noch aus der resultierenden Histogrammverteilung die Anzahl und Position der zu Grunde liegenden Populationen eindeutig erkennen lässt (Abb. 6). Die Bestimmung der prozentualen Verteilung der Populationen ist dabei mit einer großen Fehlerwahrscheinlichkeit behaftet. Bei einer abfallenden Schulter, bei der die positive Population nur noch angedeutet wird, sollte man versuchen die Färbung zu verbessern, um so die positive Population weiter von der negativen zu trennen. Eine nur schwach darstellbare, vermeintlich positive Population kann auch durch falsche Kompensation, ein Färbeartefakt, autofluoreszente Zellen oder Zellaggregate zustande kommen.
Abb.4: Simulation einer Negativkontrolle. Der Schwellenmarker (rot) wurde hart an die Grenze der negativen Population gesetzt, so dass ein positiver Wert von 0,1% angezeigt wird (Background). Alles was über diese Schwelle hinaus geht wird als positiv gewertet (Schwellenmethode).
Abb.5: Simulation einer negativen und positiven Population. Der Schwellenmarker (rot) hat hier die gleiche Position wie in Abb. 4. Der Talmarker (blau) wurde in die Mitte zwischen den Populationen gesetzt. Die Differenz der beiden Methoden ist, bei diesen klar getrennten Populationen, unbedeutend.
Abb.6: Simulation einer überlappenden negativen und positiven Population. Die zugrunde liegenden wirklichen Populationen sind grün dargestellt. Der Schwellenmarker (rot) hat die gleiche Position wie in Abb. 4, der negativ Kontrolle. Der Talmarker (blau) wurde in die Talsohle zwischen den Populationen gesetzt. Der Fehler der Schwellenmethode beträgt 21,2% und ist somit größer als die hälfte der tatsächlich positiven Population von 33,7%. Dagegen hat die Talmethode eine vergleichsweise geringe Abweichung von nur 3,5%.
Abb.7: Hier der direkte Vergleich von Talmethode und Schwellenmethode bei verschieden getrennten Populationen. Es ist deutlich zu erkennen, dass nur im oberen Beispiel die Schwellenmethode anwendbar ist, wenn man eine Kompensation nicht mitberücksichtigen muss (vergleiche Abb. 3). Im unteren Beispiel ist nur noch eine in den positiven Bereich hineinragende Schulter zu erkennen - in diesem Fall sollte versucht werden die Färbung zu verbessern oder über eine Gate-Strategie die nur schwach positive Population heraus zu arbeiten.
Grenzen der Auflösbarkeit überlappender Populationen
Sofern eine positive Population nur schwach aus einer negativen Population hinausragt, ist ein sicheres Abtrennen der positiven Population nicht mehr möglich, da praktisch nur noch eine Population vorliegt. Außerdem sollte man berücksichtigen, dass jede Gaußverteilung durch beliebig viele kleinere Gaußverteilungen darstellbar ist. Das folgende Beispiel (Abb. 8) zeigt eine verrauschte Gaußverteilung, die durch drei kleinere verrauschte Gaußverteilungen erzeugt wurde
Abb.8: Dieses Beispiel zeigt deutlich, dass es nicht zulässig ist, bei einer solchen Kurve von drei zugrunde liegenden Populationen zu sprechen.
Referenzen
- Andreas Radbruch: Immunofluorescence: Basic Considerations; Flow Cytometry and Cell Sorting, Second Edition, Editor A. Radbruch, Springer Verlag (2000)
- Klaus L. Meyer: Isolierung von Antikörpern gegen Zelloberflächenantigene mit Hilfe des Fluoreszenz-aktivierten Zell-Sortierers. Diplomarbeit, Köln, 1987
- Oi V.T., A.N. Glaser, L. Stryer: Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. J. of Cell. Biol. 93, 981 (1982)