High Speed Sort
High-Speed-Sort
Ein so genannter "High Speed Sort" ist von verschiedenen Faktoren abhängig und verlangt als Vorbedingung einen hohen Durchfluss der Zellen im Flüssigkeitsstrahl des Trägermediums PBS (z.B. 30m/sec) und eine hohe Aufteilung des Strahls in viele kleine Tröpfchen mittels einer "Drop Drive Frequency" von z.B. 90 kHz. Damit wird bei einer Durchflussrate (Flow Rate) von 30,000 events/sec durchschnittlich eine Zelle auf jedes dritte Tröpfchen verteilt. Weiterhin muss die Konzentration der Partikel auf ca. 1*107 bis 3*107 Zellen pro ml angehoben werden damit eine entsprechende Partikeldurchflussrate (Particle Flow Rate) erreicht werden kann. Für die Effizienz der Sortierung ist dann nur noch der prozentuale Anteil der zu sortierenden Partikel verantwortlich. Bei einer zu sortierenden Population von z.B. 80% geht die Sortiereffizienz bei 30,000 events/sec nur auf 90% zurück. Dagegen fällt bei einer kleinen Population von nur 0.1% zu sortierender Zellen die Effizienz auf 60% (siehe Abb. 1). Bei einer kleinen Population muss man, um die Sortiereffizienz in einem erträglichen Rahmen zu halten, entweder die Flow Rate senken oder den prozentualen Anteil der positiven Population, über eine Voranreicherung (z.B. MACS®), anheben. Bei einer hohen Probendichte von z.B. 3*107 Zellen pro ml ist die Qualität der Partikel auch von großer Bedeutung. Die Zellen müssen als Einzelzellsuspension und ohne Zellaggregate oder gar Klumpen vorliegen. Daher sollte bereits bei der Präparation bzw. bei den Kulturbedingungen darauf geachtet werden, dass die Zellen möglichst pfleglich behandelt werden um so tote Zellen mit auslaufender DNA (begünstigt die Bildung von Zellaggregaten) zu vermeiden. Nach der Zellpräparation bzw. vor der Sortierung muss jede Probe in PBS mit 2 mM EDTA und, zur Schonung der Zellen, mit 2 - 5% FKS überführt und gefiltert werden. Bei dem Einsatz einer 70 µm Düse sollte als Filter eine Nylongaze mit einer Maschenweite von < 50μm verwendet werden. Nicht gefiltertes Material kann zur Blockierung der Düse und damit zu erheblichem Arbeitsaufwand und somit zu nachhaltigen Verzögerungen führen. Bis zur Sortierung sollte die Einzelzellsuspension dunkel und auf Eis gelagert werden.
Abb. 1: Die Effizienz einer Sortierung hängt prinzipiell nur von der Durchflussrate (Flow Rate) der Partikel und dem prozentualen Anteil der zu sortierenden Zellen ab. Die Abbildung zeigt, dass bei einer zu sortierenden Population von z.B. 80%, selbst bei einer hohen Flow Rate, die Ausbeute an sortierten Zellen gut ist. Dagegen geht aber bei einer kleinen (0.1% positiven) zu sortierenden Population die Effizienz, mit dem anstieg der Flow Rate, stark zurück und eine Voranreicherung ist sinnvoll.
Methode
Material:
- Konzentration der Einzelzellsuspension: 1 - 3 * 107/ml
- PBS mit 2 mM EDTA und eventuell 2 - 5 % FKS
Damit sollte eine Sortierung mit 20.000 events/sec und mehr möglich sein.
Referenzen
- Howard M. Shapiro, Practical Flow Cytometry, 4th edit. Wiley-Liss, New York (2003)
- Göttlinger C.,Mechtold B.,Meyer KL. and Radbruch A.: Setup of a Flow Sorter; Flow Cytometry and Cell Sorting, Second Edition, Editor A. Radbruch, Springer Verlag (2000)
- Stefan Miltenyi, Werner Müller, Walter Weichel, and Andreas Radbruch: High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry 11, 231 (1990)