Multiparameteranalyse
Multiparameteranalyse
Der größte Vorteil eines Durchflusszytomerters ist die Korrelation mehrerer Zelleigenschaften mittels der Mehrfarbenfluoreszenzanalyse (Multi-Color Analyse) auf Einzelzellniveau. Die Mehrfarbenfluoreszenzanalyse ermöglicht die Korrelation mehrerer Zelleigenschaften und ist somit unerlässlich bei der Darstellung kleiner Subpopulationen, bei der Untersuchung der Zelldifferenzierung, der Zellproliferation und der Protein (Antigen) -expression. Neben der gemeinsamen Anregbarkeit der Farbstoffe müssen die einzelnen Emissionsmaxima deutlich voneinander getrennt sein zur Messung mit den verschiedenen Detektoren (Photo Multiplier Tubes, PMTs). Aufgrund der Profile der optischen Filter und der überlappenden Emissionsspektren (siehe Abb. 2) kann eine Kompensation (anteiliges abziehen der benachbarten Emissionsspektren) notwendig werden. Die meisten parallel eingesetzten Fluorochrome sind direkt an Antikörper gekoppelt aber auch an sekundäre Reagenzien wie z.B. Avidin aus Streptococcus (StrAv) und sind mit 488nm oder 633nm anregbar. Kombiniert werden können diese fluoreszenzmarkierten Antikörper mit biochemischen Markern wie z.B. Fluorescein diacetat (FDA, Esteraseaktivität) oder Chloromethylfluorescein-diacetate (CMFDA) und DNA Farbstoffen wie z.B. Propidiumjodid (PI) oder Chromomycin A3. Eine kleine Übersicht der Fluoreszenzfarbstoffe findet sich unter FACS Infos.
Hier ein Beispiel (Abb.3) für eine 7-Parameteranalyse mit fünf Fluoresenzfarbstoffen und 2 Lasern (488nm + 633nm). Die Abbildungen 1 und 2 zeigen die zugehörigen Anregungsspektren bzw. Emissionsspektren.
Abb. 1: Die Abbildung zeigt die Anregungsspektren von Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Propidiumjodid (PI), dem Tandem-Konjugat PE-Cy7 und von Allophycocyanin (APC). FITC, PE, PI und PE-Cy7 werden bei 488 nm und APC bei 488 nm angeregt.
Abb. 2: Hier werden die Emissionsspektren von Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Propidiumjodid (PI), PE-Cy7 und Allophycocyanin (APC) gezeigt. Diese Farbstoffkombination ist gut einsetzbar da die Emissionsmaxima deutlich voneinander getrennt sind, PI nur zum Ausschließen toter Zellen dient und APC zeitversetzt vom 633nm Laser angeregt wird. Aufgrund überlappender Spektren muss zwischen FITC und PE kompensiert werden. Zwischen PE und PI braucht nicht kompensiert zu werden da PI nur zum Ausschließen der toten Zellen dient (Kato K. and A. Radbruch; Cytometry 14, 384 (1993)).
Die Laser-/Farbstoffkombination mit den verwendeten Filtern
| Laser | Fluorochrome | Filter |
|---|---|---|
| 488nm | FITC (Fluorescein-5-isothiocyanat) | 530 / 30 nm |
| PE (Phycoerythrin) | 576 / 26 nm | |
| PI (Propidiumjodid) | 695 / 40 nm | |
| PE-Cy7 (Tandem-Konjugat) | 780 / 60 nm | |
| 633nm | APC (Allophycocyanin) | 660 / 20 nm |
Abb.3: Hier das Beispiel für eine 7-Parameteranalyse mit fünf Fuoreszenzfarbstoffen mit 2 Lasern (488nm + 633nm) angeregt werden. Die Abbildung zeigt auch die selektive Wirkung (vergleichbar mit einem Filter) von hintereinander geschalteten Gates zur Darstellung einer kleinen Subpopulation. Die oben beschriebene Farbstoffkombination ist hier auf abgereicherten Maus-Milzzellen 
(Depletion mit MACS) angewandt worden um eine kleine B220 positiv (Coffman R.L. and I.L. Weissman, Nature 289, 681, (1981); siehe auch Diplomarbeit, Köln, 1987), Subpopulation darzustellen und sortieren zu können. A: Darstellung der Milzzellen im Vorwärtsstreulicht (FSC, Forward Scatter) und Seitenstreulicht (SSC, Side Scatter). Das 1. Gate (Region P1) wird auf Lymphozyten gesetzt (Lymphozyten-Gate). B: Die im Lymphozyten-Gate definierte Zellpopulation wird in einer PI versus PE Darstellung benutzt, zum Ausschließen (Ausgaten) toter, PI-positiver und der PE-positiven Zellen (P2). C: Hier werden die in A und B gegateten Zellen (lebende Lymphozyten ohne PE-positive) als PE-Cy7-Positive-Zellen und FITC-positive Lymphozyten dargestellt. Zur weiteren Unterteilung werden die FITC-positiven (Region P4) und FITC-negativen Zellen (P3) gegatet. Region P4 wird in D weiter verwendet in dem noch die APC Färbung berücksichtigt wird. Region P5 wird zum Sortieren der lebenden, kleinen PI-, PE-, FITC+, PE-Cy7+, APC+ Subpopulation von ca. 0.7% verwendet.
Mit Hilfe weiter Farbstoffe ist es möglich eine Mehrfarbenfluoreszenzanalyse (Multi-Color Analyse) mit 7 oder sogar 11 Fluoreszenzfarbstoffe durchzuführen (S.C. De Rosa et al., Nat. Med. 7, 245, (2001)). Der Vorteil einer Multi-Color Analyse ist, dass eine größere Analysetiefe erreichbar ist und somit weiterführende Erkenntnisse über Populationsverteilungen und Zelleigenschaften gewonnen werden können. Es ist möglich komplexe immunophänotypische Analysen mit funktionellen und biochemischen Analysen zu kombinieren. Wichtig dabei ist, das sog. "Gaten" (definieren einer Region) und die damit erzielbaren Zusammenhänge, zu zellulären Eigenschaften bzw. zwischen den Populationen, sichtbar zu machen.
Referenzen
- Margret Ehlers, Claudia Papewalis, Wiebke Stenzel, Benedikt Jacobs, Klaus L. Meyer, René Deenen, Holger S. Willenberg, Sven Schinner, Annette Thiel, Werner A. Scherbaum, Evelyn Ullrich, Laurence Zitvogel, and Matthias Schott Immunoregulatory Natural Killer Cells Suppress Autoimmunity by Down-Regulating Antigen-Specific CD8+ T Cells in Mice. Endocrinology. First published ahead of print June 25, 2012 as doi:10.1210/en.2012-1247
- De Rosa, S.C., Herzenberg, L.A., and Roederer, M., 11-color, 13-parameter flow cytometry: Identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat. Med. 7:245-248 (2001)
- Kimitaka Kato and Andreas Radbruch; Isolation and Characterization of CD34+ Hematopoietic Stem Cells From Human Peripheral Blood by High-Gradient Magnetic Cell Sorting. Cytometry 14:384-392 (1993)
- Klaus L. Meyer, Isolierung von Antikörpern gegen Zelloberflächenantigene mit Hilfe des Fluoreszenz-aktivierten Zell-Sortierers. Diplomarbeit, Köln, 1987
- Coffman R.L. and I.L. Weissman, B220: a B cell-specific member of the T200 glycoprotein family. Nature 289, 681, (1981)