HNPCC

Funktionelle Studien von hMLH1 und hMSH2-Proteinvarianten von Patienten des Deutschen HNPCC-Konsortiums

Projekt in Zusammenarbeit mit:

Prof. Dr. B. Royer-PokoraInstitut für Humangenetik und AnthropologieHeinrich-Heine Universität Düsseldorf

Zusammenfassung:

Das hereditäre, nicht polypöse kolorektale Karzinom (HNPCC) ist mit Keimbahnmutationen in den DNA Mismatch-Reparaturgenen hMLH1, hMLH3, hMSH2, hMSH6, hPMS1 und hPMS2 assoziiert. Mutationen in einem dieser Gene werden bei 70% der HNPCC-Patienten gefunden. Hierbei sind Kettenabbruch- und Spleißmutationen eindeutig als pathogen einzustufen, während bei den Missense-Mutationen die Bedeutung fast immer unklar bleibt. Im Rahmen des Verbundprojektes "Krebsvorsorge und Krebsfrüherkennung bei Familiärem Darmkrebs" (Deutsche Krebshilfe) werden in der Leipziger Datenbank Missense-Mutationen der Gene hMLH1, hMSH2 und hMSH6 unklarer Pathogenität registriert, deren Auswirkungen auf die Funktion der betroffenen Proteine gegenwärtig schwer einzuschätzen sind. Die funktionelle Analyse von MLH1-Missense-Mutationen in der Hefe war Bestandteil unseres seit 15 Monaten geförderten Projektes. Die Analyse der Interaktion von hMLH1-Varianten mit seinem Partner hPMS2 im Hefe-2-Hybridsystem (H2H) erlaubt erste Aussagen über die Funktionsfähigkeit der untersuchten Varianten. Im Fortsetzungsantrag werden weitere neue, in Patienten gefundene hMLH1-Mutationen auf ihre Funktion im H2H-Assay charakterisiert. Als weiterer Test wurde für hMLH1 sowie für hMSH2 der dominant negative Mutator-Assay etabliert. Hierbei führt die erhöhte Expression von Wildtyp-hMLH1 oder -hMSH2 in MMR-kompetenten Hefestämmen zu einer zirka 2.000- bis 5.000-fachen Erhöhung der Mutationsrate, während nicht funktionelle hMLH1- oder hMSH2-Allele diesen dominanten Mutatoreffekt nicht aufweisen und somit pathogen sind. Zur in vivo MMR-Analyse von hMLH1-Varianten haben wir einen weiteren in vivo MMR-Assay in der Hefe etabliert, bei dem Hybridproteine aus humanem hMLH1 und Hefe-Mlh1 generiert wurden, welche zu einer partiellen Wiederherstellung der MMR-Funktion in einem Hefe-Mlh1-Deletionsstamm führten. Im humanen Proteinanteil sollen zukünftig Missense-Mutationen eingefügt und so auf ihre in vivo MMR-Funktion in der Hefe getestet werden. Im Rahmen unseres Projektes gelang uns die Generierung des ersten, in Hefe voll funktionsfähigen Hefe-Mensch Msh2-Hybridproteins. Damit werden in diesem Fortsetzungsprojekt die im humanen Sequenzanteil des Hybridproteins gelegenen und bisher nicht untersuchten hMSH2-Missense-Allele auf ihre in vivo MMR-Funktion getestet. Im Laufe des Projektes sollen weitere Msh2-Hybridproteine generiert werden, um so zusätzliche Missense-Mutationen testen zu können. Als neuer Test wurde die Analyse der Proteinstabilität der Mutantenproteine in menschlichen Zellen mit Hilfe von Western Blot-Analysen in dieses Projekt aufgenommen. Hierbei wird gleichzeitig die subzelluläre Lokalisation des hMLH1-GFP-Proteins in An- oder Abwesenheit des unmarkierten hPMS2-Proteins und umgekehrt des hPMS2-GFP-Proteins mit unmarkiertem hMLH1 analysiert. Da hPMS2 nur zusammen mit dem hMLH1-Protein in den Kern wandern kann, ist die Kernlokalisation dieses Proteins ein Nachweis für funktionelle Interaktion. Für eine Gesamtbewertung der verschiedenen funktionellen Teste ist der Aufbau einer umfassenden Funktionsdatenbank vorgesehen, welche letztendlich zur Entwicklung eines Algorithmus zur Vorhersage des Pathogenitätspotentials einer Missense-Mutation führen soll.